Věstník MŽP ČR, částka 1/2017
Příloha č. 7
Postupy detekce přítomnosti geneticky modifikovaných mikroorganismů
- Zjišťování kontaminace vzduchu
Metoda slouží k monitorování úniku GMM do prostoru. Tuto kontrolu se doporučuje provádět 1x za 6 měsíců, a dále po každé mimořádné události. Provádí se rozložením otevřených Petriho misek s agarovým mediem v uzavřeném prostoru. Půda v agarových miskách má být svým složením specifická pro testované mikroorganismy, s nimiž se pracuje, a u kterých nastala možnost úniku. Je vhodné použít medium obsahující antibiotikum, které selektuje modifikované mikroorganismy s příslušným rezistenčním markerem (signálním genem). Misky s agarovým mediem se otevřené položí do uzavřeného prostoru. Po 15 minutách se opět přikryjí a nechají inkubovat v termostatu při teplotě vhodné pro růst hledaných mikroorganismů (např. na 37 °C nebo 30 °C) po dobu 3 dnů. V případě nárůstu kolonií se postupuje podle hodnocení rizika příslušného nakládání. Je třeba provést důkladnou dezinfekci ploch alternativními dezinfekčními prostředky a dezinfekci prostoru ozařováním germicidní UV-lampou po dobu 1 hodiny, případně přes noc.
V případě opakovaného nárůstu kolonií v prostoru, kde probíhá nakládání s GMM 2. kategorie rizika, je třeba testovat mikrobiální izoláty vzrostlé na Petriho miskách pomocí metody PCR s použitím vhodných primerů. V případě pozitivní PCR je třeba dosáhnout účinné inaktivace detegovaného GMM.
-
Zjišťování kontaminace povrchů stěrovou metodou
Metoda se provádí setřením sledovaného povrchu sterilní gázou a následným rozetření stěru na Petriho misky s vhodným agarovým mediem (stejně jako při zjišťování kontaminace vzduchu). V případě nárůstu kolonií se postupuje stejně jako při zjišťování kontaminace vzduchu.
- Detekce GMO pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR)
V krajním případě, kdy nelze identifikovat přežívající mikroorganismy, se provádí jejich detekce pomocí metody PCR. Amplifikované úseky DNA lze dále přesně charakterizovat sekvenováním a porovnáváním se sekvencí předpokládaného modifikovaného úseku v GMM.
Vzor testu přítomnosti modifikované DNA s využitím PCR:
Složení reakční směsi a program automatického cyklem:
|
Složka |
Objem |
|
Extrakt testovaného vzorku |
1 µl |
|
10x konc. pufr pro DNA polymerasu |
5 µl |
|
dNTP (20mM) |
1 µl |
|
Oligonukleotid 1 |
1 µl (50 pmol) |
|
Oligonukleotid 2 |
1 µl (50 pmol) |
|
Pfu polymerasa |
1 µl |
|
voda destilovaná |
40 µl |
|
Číslo cyklu |
Počet cyklů |
Teplota (°C) |
Čas (s) |
|
1 |
1 |
94 |
120 |
|
2 |
30 |
94 |
30 |
|
50 |
30 |
||
|
72 |
60 |
||
|
3 |
1 |
72 |
300 |
10 µl produktu se vizualizuje a zkoumá pomocí elektroforetické analýzy. Amplifikovaný úsek DNA lze případně charakterizovat sekvenováním.