Sedmá xxxxxxxx Xxxxxx
xx xxx 1. xxxxxx 1976,
xxxxxx se xxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxx Xxxxxxxxxxxx xxx úřední xxxxxxxx xxxxx
(76/372/XXX)
XXXXXX EVROPSKÝCH XXXXXXXXXXXX,
x xxxxxxx xx Xxxxxxx x xxxxxxxx Evropského xxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx,
x xxxxxxx xx xxxxxxxx Xxxx xx xxx 20. xxxxxxxx 1970 o xxxxxxxx metod odběru xxxxxx x xxxxxxxxxxxx xxxxx Xxxxxxxxxxxx xxx xxxxxx xxxxxxxx krmiv [1], naposledy xxxxxxxxxx xxxxx o přistoupení [2], x zejména xx xxxxxx 2 xxxxxxx xxxxxxxx,
xxxxxxxx k xxxx, že xxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxx, xx xxxxxx kontroly xxxxx, xxxxxxx cílem je xxxxxx dodržování xxxxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxx x xxxxxxxxx xxxxxxxx a xxxxxxxxxx se xxxxxxx x xxxxxxx krmiv, xx xxxxxxxxx xxxxx xxxxx xxxxxx xxxxxx x xxxxxxxxxxxx xxxxx Xxxxxxxxxxxx;
xxxxxxxx x xxxx, xx směrnice Xxxxxx 71/250/XXX xx xxx 15. xxxxxxxx 1971 [3], 71/393/XXX xx xxx 18. xxxxxxxxx 1971 [4], 72/199/XXX xx xxx 27. xxxxx 1972 [5], 73/46/XXX xx dne 5. xxxxxxxx 1972 [6], 74/203/EHS ze xxx 25. března 1974 [7] x 75/84/XXX ze xxx 20. xxxxxxxx 1974 [8] již xxxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxxxx xxxxx Xxxxxxxxxxxx; xx x xxxxxxx na xxxx xxxxxxx provedených prací xx xxxx xxxxx xxxxxxxx sedmou xxxxx xxxxxxxxxxxx metod;
vzhledem k xxxx, xx xxxxxxxx xxxx xxxxxxxx xxxx x xxxxxxx xx xxxxxxxxxxx Xxxxxxx výboru xxx xxxxxx,
XXXXXXX XXXX XXXXXXXX:
Článek 1
Xxxxxxx státy xxxxxxx, xx analýzy xxx úřední xxxxxxxx xxxxx, xxxxx jde x xxxxx xxxxxxxxxx X1, xx xxxxxxxxx xxxxx metod xxxxxxxxx x xxxxxxx této xxxxxxxx.
Xxxxxx ustanovení uvedená x xxxxx 1 (xxxx) xxxxxxx xxxxx xxxxxxxx Xxxxxx 71/250/XXX xx dne 15. xxxxxxxx 1971, s xxxxxxxx části xxxxxxxx xx přípravy vzorku x analýze, xx xxxxxxx xxx metody xxxxxxx x příloze xxxx směrnice.
Xxxxxx 2
Xxxxxxx xxxxx xxxxxx x xxxxxxxx xxxxxx a xxxxxxx xxxxxxxx nezbytné pro xxxxxxxx souladu x xxxxx směrnicí xxxxxxxxxx xx 1. xxxxx 1976. Xxxxxxxxxx o xxxx xxxxxxxxx Xxxxxx.
Xxxxxx 3
Tato směrnice xx určena členským xxxxxx.
X Xxxxxxx dne 1. března 1976.
Xx Xxxxxx
X. J. Lardinois
člen Xxxxxx
[1] Úř. xxxx. X 170, 3.8.1971, x. 2.
[2] Xx. xxxx. X 73, 27.3.1971, x. 14.
[3] Xx. xxxx. X 155, 12.7.1971, x. 13.
[4] Xx. věst. X 279, 20.12.1971, x. 7.
[5] Xx. xxxx. X 123, 29.5.1972, x. 6.
[6] Xx. xxxx. X 83, 30.3.1973, x. 21.
[7] Xx. věst. X 108, 22.4.1974, x. 7.
[8] Úř. xxxx. X 32, 5.2.1975, x. 26.
XXXXXXX
XXXXXXXXX XXXXXXXXXX X1
X. XXXXXX JEDNOROZMĚRNÉ TENKOVRSTVÉ XXXXXXXXXXXXXX
1. Xxxx x xxxxxx
Xxxx xxxxxx umožňuje xxxxxxxx xxxxx xxxxxxxxxx X1 v těchto xxxxxxxx: xxxxxxxxxx xxxxxx, xxxxx, xxxxx semena, xxxx, xxxxx, babassu xxxxx a xxxxxxxxx xxxxxx, xxxxxxxxx a xxxxxxx x xxxxxxxx, xxxxxxxx mouka, bramborová xxxxx a škrob. Xxxxxx xxxxxxx xxx xxxxxxxxx je 0,01 xx/xx (10 xxx).
Xxxxx xxxx přítomny xxxxxx xxxxx, xxxxx xxxxxxx xxxxxxxxx, xx xxxxx xxxxxxxx xxxxxxx podle xxxxxx B (xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx).
2. Princip
Vzorek xx xxxxxxxxx chloroformem. Xxxxxxx xx xxxxxxxx x jeho xxxxxxxxx xxxx xx odebere x xxxxxxxx kolonovou xxxxxxxxxxxxxx xx xxxxxxxxxx. Xxxxx se xxxxxx x xxxxxxxx se xxxxxxxx xx xxxxxxxxxx xxxxxx chloroformu xxxx xx xxxxx benzenu x acetonitrilu. Alikvotní xxxx xxxxxx roztoku xx xxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx. Xxxxxxxx aflatoxinu X1 xx xxxxxxx x xxxxxxxxxxxxx xxx XX xxxxxxx buď xxxxxxxx xxxx fluorimetricky xxxxxxxxx xx známými xxxxxxxxxx standardu xxxxxxxxxx X1. Xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 extrahovaného z xxxxx xxxx xxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxx postupem.
3. Xxxxxxx
Xxxxxxxx:
Xxxxx xxxx xxxxxxxxx xxxxx, xxxxxxx činidla xxxx xxx xxxxxxx "x. x".
3.1 Xxxxxx.
3.2 Xxxxxxxxxx stabilizovaný 0,5 xx 1,0 xxxxxxxxx 96 % (X/X) xxxxxxxx.
3.3 X–xxxxx.
3.4 Xxxxxxxx.
3.5 Xxxxxxxxxxxx, xxxxxxx, xxxxxxxxxxxx xxxxxxxx.
3.6 Xxxx xxxxxxx x acetonitrilu: 98/2 (X/X).
3.7 Xxxx xxxxxxxxxxx (3.2) x methanolu (3.4): 97/3 (X/X).
3.8 Xxxxxxxxx pro xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx, xxxxxxxx částic 0,05 až 0,20 xx.
3.9 Absorbent – xxxx, xxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx, xxxx skelná xxxx.
3.10 Xxxxx sodný, xxxxxxx, xxxxxxxxxxx.
3.11 Xxxxxxx xxxx, xxxx. dusík.
3.12 Xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx 1 X.
3.13 50 % (X/X) xxxxxxxx sírová.
3.14 Xxxxxxxxx (xxxxxxxxxxxxx), promytá xxxxxxxxx.
3.15 Silikagel X–XX xxxx xxxxxxxxxx, xxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx.
3.16 Xxxxxxxxxx xxxxxx obsahující asi 0,1 μx xxxxxxxxxx X1 xx 1 xx chloroformu (3.2) xxxx xxxxx benzenu x xxxxxxxxxxxx (3.6), xxxxxxxxxx x xxxxxxxxxxxxx, xxx je xxxxxxx x xxxx 7.
3.17 Xxxxxxxxxx roztok xxx xxxxxxxxx xxxxxxx xxxxxxxxxx xxx 0,1 μg xxxxxxxxxx B1 x X2 na 1 xx xxxxxxxxxxx (3.2) xxxx směsi xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx (3.6). Xxxx xxxxxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxx. Xxxx xxx xxxxxxxx xxx, xxx xx xxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx x xxxx xxxxxxxxxx.
3.18 Xxxxxxxx xxxxxxxxxxxx:
3.18.1 Chloroform (3.2)/xxxxxx (3.1): 9/1 (X/X), xxxxxxxxxxxxxxxx tank s xxxxxxxxxxx atmosférou;
3.18.2 Xxxxxxxxxxxx (3.5)/xxxxxxxx (3.4)/voda: 96/3/1 (X/X), xxxxxxxxxxxxxxxx xxxx x xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx;
3.18.3 Xxxxxxxxxxxx (3.5)/xxxxxxxx (3.4)/xxxx: 94/4.5/1.5 (V/V), xxxxxxxxxxxxxxxx xxxx s xxxxxxxxx xxxxxxxxxx;
3.18.4 Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 94/6 (V/V), xxxxxxxxxxxxxxxx xxxx s xxxxxxxxx xxxxxxxxxx;
3.18.5 Chloroform (3.2)/xxxxxxxx (3.4): 97/3 (X/X), chromatografický xxxx x xxxxxxxxx xxxxxxxxxx.
4. Xxxxxxxxx
4.1 Drtič – xxxxx.
4.2 Xxxxxxxx nebo xxxxxxxxxx míchačka.
4.3 Xxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxx, Xxxxxxxxxx x Xxxüxx x. 588 xxxx ekvivalentní, xxxxxx 24 cm.
4.4 Xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxx (xxxxxxx xxxxxx 22 xx, xxxxx 300 xx) s xxxxxxxxxx xxxxxxxx x 250 μx xxxxxxxxxx.
4.5 Rotační xxxxxxx xxxxxxx, x xxxxxx o xxxxxx 500 ml x xxxxxxx xxxx.
4.6 Xxxxxxxxxxxxx xxxxx o objemu 500 xx, xx xxxxxxxxxxx xxxxxxx.
4.7 Xxxxxxxx xxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx.
4.8 Xxxxxxxx xxxxx pro xxxxxxxxxxxx chromatografii, 200 x 200 xx, xx připraví xxxxx (xxxxxxx xxxxxxxx xxxxx xxx xxx xxxxx): xxx 30 x xxxxxxxxxx X-XX (3.15) xx Xxxxxxxxxxxxx baňky, xxxxxx 60 xx xxxx, xxxxxxxxxx x xxxxxxxxxxx 1 xxxxxx. Xxxxxxxxxxx suspenzi xx xxxxx xxxxxxx xxxxxxxx, xxx se xxxxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxx x xxxxxxxx 0,25 mm. Xxxxxx xxxxxxxx xx xxxxxxx x xxxx xxxxxxx v desikátoru xxxxxxxxxxx silikagel. Xxxx xxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxx xxxxx xxxxxx x xxxxxxx xxx 110 °X.
Xxxxx připravené x xxxxxxx xxxx xxxxxxxxxx, xxxxx xxxxxxxx xxxxxxx xxxxxxxx xxxx xxxxx xxxxxxxxxx xxxxx uvedeného xxxxxxx.
4.9 UV xxxxx xxxxxxxxxxx (360 xx). Xxxxxxxxx xxxxxx musí xxx dostatečná, xxx xxxxxx 1 xx xxxxxxxxxx X1 xx xxxxx xxx tenkovrstvou xxxxxxxxxxxxxx xxxx xx xxxxxxxxxx 10 cm xx lampy ještě xxxxx xxxxxxxxxxxx.
4.10 Odměrné xxxxxxxx x xxxxxx 10 ml, x xxxxxxxxxxxxxxxx zátkami.
4.11 XX xxxxxxxxxxxxxxx.
4.12 Xxxxxxxxxx (xxxxxxxxx).
5. Xxxxxx
5.1 Příprava xxxxxx (xxx "Xxxxxxxx", xxxx X xxx 1)
Rozmělnit xxxxxx xxxxxxx způsobem, xxx xxxx xxxxxx xxxxx x xxx x xxxxxxxxx 1 xx (v xxxxxxx x xxxxxxxxxxx XXX X 565).
5.2 Extrakce
Do Xxxxxxxxxxxxx xxxxx x xxxxxx 500 xx xxx 50 x xxxxxxxxxxx x xxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxx. Xxxxxx 25 x křemeliny (3.14), 25 xx xxxx x 250 xx xxxxxxxxxxx (3.2). Xxxxxxxxxx, xxxxxxxxxxx nebo xxxxxxxxxxx 30 xxxxx xxxxxxxxx (4.2) a přefiltrovat xxxx xxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxx (4.3). Xxxxxxxxx xxxxxxx 10 ml xxxxxxxx, poté sebrat 50 xx.
5.3 Přečištění xx xxxxxx
Xx xxxxxx xxxxx chromatografické trubice (4.4) xxxxxx xxxxx x xxxx xxxx xx xxxxxx xxxx (3.9), xxxxxxx trubici xx do dvou xxxxxx xxxxxxxxxxxx (3.2), x xxxx přidat 5 x xxxxxx xxxxxxx (3.10).
Xxxxxx, xx xxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx sodného je xxxxx xxxxx, x xxxx xxxxxx xx xxxxxx dávkách 10 x silikagelu (3.8). Xx každém přidání xxxxxxx zamíchat, aby xx xxxxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxx. Nechat 15 xxxxx xxxx, x xxxx opatrně xxxxxx 15 g xxxxxx xxxxxxx (3.10). Nechat xxxxxxxx xxxxxxxx až x xxxxxxx xxxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxxx.
Xxxxxxx 50 ml extraktu xxxxxxxxx xxxxx xxxx (5.2) xx 100 xx x-xxxxxx (3.3) x směs xxxxxxxxxxxxx xxxxxx xx xxxxxx. Xxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxx xx k hornímu xxxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxxx. Přidat 100 xx diethyletheru (3.5) x znovu nechat xxxxxxxx xxxxxxx xx x xxxxxxx povrchu xxxxxx xxxxxx xxxxxxx. Xxxxx xxxxxx xxxxxxx xxxx xx to, xxx xxxxxxxx průtoku xxxx 8 xx 12 xx xx xxxxxx x xxx xxxxxx xxxxxxxxx. Xxxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxxx. Xxxx xxxxxxx 150 ml xxxxx xxxxxxxxxxx x xxxxxxxxx (3.7) a xxxxxx xxxx xxxxx.
Xxxxxxx xxxxx xx xxxxx xxx proudem xxxxxxxxx xxxxx (3.11) x xxxxxxx xxxxxxx odparce (4.5) xxx xxxxxxx xxxxx xxx 50 °X. Xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxx xxxxxxx xx použití xxxxxxxxxxx (3.2) nebo xxxxx xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx (3.6) xx xxxxxxx zkumavky x xxxxxx 10 xx (4.10). Xxxxxxxxxxxx xxxxxx xxx xxxxxxx xxxxxxxxx xxxxx (3.11), x xxxx xxxxxxx objem xx 2 xx xx použití xxxxxxxxxxx (3.2) nebo xxxxx xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx (3.6).
5.4 Tenkovrstvá chromatografie
Na xxxxx xxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx (4.8) nanést 2 xx xx xxxxxx xxxxx x x odstupech xx 2 xx tyto xxxxxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx x xxxxxxxx:
- 10, 15, 20, 30 x 40 μx xxxxxxxxxxxx roztoku xxxxxxxxxx X1 (3.16),
- 10 μx xxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxx bodu 5.3 x x xxxx 20 μx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16),
- 10 x 20 μx xxxxxxxx získaného podle xxxx 5.3.
Xxxxxxxxxxxx se xxxxxx ve tmě xx použití xxxxxxx x xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx (3.18). Xxxxx xxxxxxxxxxxx xx xxxx provést xxxxxx nanesením 25 μx jakostního xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.1) na xxxxx x musí xx xxxxxx, xxx xxxx xxxxxxxxxx X1 x B2 při xxxxxxxx xxxxx xxxxxxxx.
Xxxxxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx xx xxx x poté xxxxxx xxxxx XX xxxxxxx xx xxxxxxxxxxx 10 xx od xxxxx (4.9). Skvrny xxxxxxxxxx B1 modře xxxxxxxxxxx.
5.5 Xxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxx
Xxxxxxxxx xx xxxxxxx xxx xxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxxxxxx xxxxx xxxxxx xxxxxx:
5.5.1 Xxxxxxxx xxxxxx
Xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 v xxxxxxxx xx stanoví porovnáním xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx skvrn xxxxxxxx x xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx skvrn xxxxxxxxxxxx xxxxxxx. X xxxxxxx xxxxxxx xx interpoluje. Xxxxxxxxxxxx získaná xxxxxxxxx xxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxx xxxxxx xxxx být xxxxxxxx než fluorescence 10 ml extraktu x xxxxx být xxxxxxxxx xxxx než xxxxx skvrna. Pokud xx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx 10 μx xxxxxxxx xxxxxxxx xxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx 40 μx xxxxxxxxxxxx roztoku, xxxxxxxx xxxxxxx 10 krát xxxx 100 krát xxxxxxxxxxxx (3.2) nebo xxxxx xxxxxxx a xxxxxxxxxxxx (3.6) x xxxx xxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx.
5.5.2 Xxxxxxxxxxxxxx xxxxxx
Xxxxxxxxx fluorescence skvrn xxxxxxxxxx X1 xx xxxx xxxxxxxxxxxx (4.12) xxx xxxxxxxxx vlnové xxxxx 365 xx x emisní xxxxx 443 xx. Xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 ve xxxxxxxx extraktu xx xxxxxxx porovnáním xxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxxxx x xxxxxxxxxxx xxxxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx aflatoxinu B1.
5.6 Xxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1
Xxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 x xxxxxxxx xx provede takto:
5.6.1 Xxxxxxxx kyselinou xxxxxxx
Xx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx podle xxxx 5.4 nastříkat xxxxxxxx sírovou (3.13). Xxxxxxxxxxxx xxxxx aflatoxinu X1 xx musí xxx UV xxxxxxx xxxxxx x xxxxx xx xxxxxx.
5.6.2 Xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx tvorbu xxxxxxxxxx X1 - xxxxxxxxxxx (aflatoxin B2a)
Poznámky:
Níže xxxxxxx xxxxxxxx postupy xx xxxx xxxxxxxx xxxxxx xxxxx xxxxxxxx xxxxxxxx xx xxxxxxx 3.
5.6.2.1 Xxxxxxxx xxxxxxx
Xxxxxxxxx xx desku (4.8) xxx přímky xxxxxxxxxx xx xxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx (6 cm xx každé xxxxxx), xxxxxx x vymezení xxxxxxx čel xxxxxxxxxxxx. Xxxxxx xx xxxxx xxxxxx kapilárních xxxxx xxxx xxxxxxxxxx mikrostříkaček xxxx roztoky:
- v xxxx A: xxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxx vzorku xxxxxxxxx xxxxx xxxx 5.3, xxxxx xxxxxxxx xxx 2,5 nm xxxxxxxxxx B1,
- x xxxxxx X a X: 25 μl xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16).
5.6.2.2 Xxxxxxxx
Xxxxxxxxxxxx se vyvíjí xx xxxxxxx vyvíjecího xxxxxxxxxxxx (3.18.1) [xxxxxx x xxxxxxxx 1 xx x xxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxx x nenasycenou xxxxxxxxxx] xx xxx xx xxxxx X, xxxxx xxxx rozpouštědla xxxxxxxxx x xxxxxxxxxx xxxxx.
Xxxxxxx desku x xxxxx x xxxxxx xxxxxxxx pět xxxxx xx xxx a xxx pokojové xxxxxxx. Xxxx xxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx (3.12) xx xxxxx x šířce 2,5 cm, xxxxx xxxxxxx body X x B (na xxxxxxx 3 vyznačeno xxxxxxxxx), xxxxx pásek xxxxxxxxx, xxxxxxx xxxxxx xxxxx xx xxxxxxx xxxxxxx papírem. Xxxxxx xxxxxxx 10 xxxxx xx xxx, a xxxx xxxxxxx xxxxx xxxxxxx xxxxxxx xxx xxxxxxxx xxxxxxx.
Xxxx se xxxxxxxxxxxx xxxxxx xx xxxxxxx vyvíjecího xxxxxxxxxxxx (3.18.1) [xxxxxx o xxxxxxxx 1 xx x xxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxx x xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx] xx tmě ve xxxxx XX, dokud xxxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxx x xxxxxxxxxx linii. Xxxxxxx desku z xxxxxxxxxxxxx tanku a xxxxxx xxxxxxxx pět xxxxx xx tmě x xxx xxxxxxxx xxxxxxx.
5.6.2.3 Interpretace xxxxxxxxxxxxx
Xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx xxx XX xxxxxxx (4.9) x xxxxxx tyto znaky:
a) Xxxxxxxx xx modré xxxxxxxxxxxxx skvrny xxxxxxxxxx X1 xxxxxxxxxxx xx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx naneseného x xxxx X (xxxxxxx xx xxxxx X).
x) Objevení xx xxxxx fluoreskující xxxxxx xxxxxxxxxx X1 (který xxxxxxxxxx x xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx) x intenzivnější xxxxx xxxxxxxxxxxxx skvrny xxxxxxxxxx X1 – xxxxxxxxxxx, přičemž xxx xxxxxx xxxxxxxxx xx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx naneseného x bodu B (xxxxxxx ve xxxxx XX).
x) Objevení xx xxxxxxxxx skvrn, xxxx xxxx xxxxxxx v xxxx x), pocházejících xx vzorku extraktu xxxxxxxxxx x xxxx X. Poloha xxxxxx xxxxx vychází xxxxxx x xxxxxxxx vzdáleností xxxxxxxxxx X1 xx xxxx X xx xxxxx I (xxxxxx xxxxxxxxxx xxxx x xxxxxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx x bodu X) x xxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 – xxxxxxxxxxx xx xxxx X xx xxxxx XX (xxxxxx xxxxxxxxxx xxxx x xxxxxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx x xxxx B). Xxxxxxxxxxxxx intenzity xxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxx z xxxxxxxx x xx xxxxxxxxxxxx vzorku naneseného x xxxx X xx xx xxxx xxxxxxxxx.
6. Výpočet xxxxxxxx
6.1 Xx základě vizuálních xxxxxx
Xxxxx xxxxxxxxxx X1 x mikrogramech na 1 kg xxxxxx (xxx) xx vypočítá xxxxxx vzorce:
S · X · X / X · X
xxx:
X a Y xxxx xxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxxxx roztoku xxxxxxxxxx X1 x xxxxxxxxxxxx (3.16) x xxxxxxxx, xxxxx má xxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx;
X = xxxxxxxxxxx, v mikrogramech xx 1 xx, xxxxxxxxxx X1 xx xxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16);
X = konečný xxxxx xxxxxxxx v xxxxxxxxxxxx, x ohledem xx xxxxxxxx ředění;
W = xxxxxxxx xxxxxxxxxx vzorku x gramech, x xxxxxxx na xxxxx xxxxxxxx xxxxxxx xxx xxxxxxxxxx na koloně.
6.2 Xx xxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxx
Xxxxx xxxxxxxxxx B1 x xxxxxxxxxxxx na 1 kg vzorku (xxx) se vypočítá xxxxxx xxxxxx:
X·X / X·X
xxx:
X = xxxxx xxxxxxxx, v mikrolitrech, xxxxxxxxxxxx xxxxx (10 μx xxxx 20 μx);
X = množství xxxxxxxxxx X1, x xxxxxxxxxxx, xx xxxxxx xxxxxxxx (poměrně x xxxxxxx hodnotě X) xxxxxxxx z xxxxxx;
X = konečný xxxxx xxxxxxxx x mikrolitrech, x xxxxxxx xx xxxxxxxx xxxxxx;
X = xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxx x xxxxxxx, x xxxxxxx xx xxxxx xxxxxxxx xxxxxxx pro xxxxxxxxxx na koloně.
7. Xxxxxxxx a xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16)
7.1 Xxxxxxxxx koncentrace aflatoxinu X1
Xxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx B1 x xxxxxxxxxxx (3.2) nebo xxxxx xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx (3.6), xxxxx xxxxxxxxxxx xx od 8 xx 10 μx/xx. Xxxxxxxx absorpční xxxxxxxx xxxx 330 x 370 nm xx použití spektrofotometru (4.11).
Xxxxxx optickou hustotu (X) xxx 363 xx v případě xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxx nebo xxx 348 xx x případě xxxxxxx xxxxx benzenu a xxxxxxxxxxxx.
Xxxxxxxxx xxxxxxxxxxx aflatoxinu X1 v xxxxxxxxxxxx xx 1 xx xxxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx:
xxx chloroformový roztok; 312 · A · 1&xxxx;000 / 20&xxxx;600
312 · X · 1 000 / 19&xxxx;800 pro xxxxxx xx xxxxx xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx..
Xx tmě xxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxx x xxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx roztok, xxxxx xxxxxxxxxxx aflatoxinu X1 je asi 0,1 μx/xx. Xxxxx xx xxxxxx xxxxxxxx x xxxxxxxxxx xxx 4 °X, je xxxxx po xxxx xxxx týdnů.
7.2 Testování xxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxx
Xxxxxx na xxxxx (4.8) 5 μx standardního xxxxxxx xxxxxxxxxxxx 8 xx 10 μl aflatoxinu X1 na 1 xx (7.1). Xxxxxxxx xxxxxxxxxxxx, xxx je xxxxxxx v xxxx 5.4. Při XX xxxxxx xx měla xxx viditelná xxxxx xxxxx xxxxxx x x místě xxxxxxxxx xxxxxxxx xx xxxxxx xxx xxxxxxxx xxxxx xxxxxxxxxxxx.
8. Xxxxxxxxxxxxxx
Xxxxxx xxxx xxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxx, xxxxx x xxxxxxx vzorku provedl xxxxxx xxxxxxxx, xxxxx xxxxxxxxx:
- 25 % xxxxxxxxxx výsledku xxx xxxxxx xxxxxxxxxx X1 xx 10 xx 20 μx/xx,
- 5 μx xxxxxxxxx xxxxxxx xxx obsahy od 20 do 50 μx/xx,
- 10 % xxxxxxxxxx xxxxxxxx pro xxxxxx vyšší xxx 50 μg/kg.
9. Reprodukovatelnost
Viz "Xxxxxxxx", xxxx X xxx 2.
X. XXXXXX XXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXX CHROMATOGRAFIE
1. Xxxx x xxxxxx
Xxxx xxxxxx umožňuje stanovit xxxxx xxxxxxxxxx B1 x xxxxxxxx, xxxxx xxxxxxxxx do xxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxx X. Xxxxxx xxxxxxx xxx xxxxxxxxx xx 0,01 xx/xx (10 xxx). Xxxx xxxxxx xx xxxxxxxxx xxx krmiva xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxx.
2. Xxxxxxx
Xxxxxx se xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx. Xxxxxxx xx xxxxxxxx x jeho xxxxxxxxx xxxx se xxxxxxx x xxxxxxxx xxxxxxxxx chromatografií xx xxxxxxxxxx. Xxxxx se xxxxxx a residuum xx xxxxxxxx xx xxxxxxxxxx xxxxxx chloroformu xxxx xx směsi xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx. Xxxxxxxxx část tohoto xxxxxxx xx podrobí xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx. Xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 xx xxxxxxx x xxxxxxxxxxxxx xxx XX xxxxxxx xxx xxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxxxxxx srovnáním xx známým xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx aflatoxinu X1. Xxxxxxxx xxxxxxxxxx B1 xxxxxxxxxxxxx x xxxxx xxxx být potvrzena xxxxxxxxxx xxxxxxxx.
3. Xxxxxxx
Xxxxxxxx:
Xxxxx xxxx stanoveno jinak, xxxxxxx xxxxxxx xxxx xxx xxxxxxx "p.a".
3.1 Xxxxxx.
3.2 Xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxx 0,5 – 1,0 xxxxxxxxx 96 % (X/X) ethanolu.
3.3 N–hexan.
3.4 Xxxxxxxx.
3.5 Xxxxxxxxxxxx, xxxxxxx, xxxxxxxxxxxx peroxidy.
3.6 Směs xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx: 98/2 (V/V).
3.7 Xxxx xxxxxxxxxxx (3.2) x xxxxxxxxx (3.4): 97/3 (X/X).
3.8 Xxxxxxxxx xxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx, velikost xxxxxx 0,05 až 0,20 mm.
3.9 Absorbent – xxxx, xxxxxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx, nebo xxxxxx xxxx.
3.10 Xxxxx xxxxx, xxxxxxx, granulovaný.
3.11 Xxxxxxx plyn, xxxx. xxxxx.
3.12 Xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx 1 N.
3.13 Xxxxxxxxx (xxxxxxxxxxxxx) xxxxxxx kyselinou.
3.14 Xxxxxxxxx G–HR xxxx xxxxxxxxxx, xxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx.
3.15 Xxxxxxxx xxxxxxx.
3.15.1 Xxxxxxxxxxxx (3.5)/methanol (3.4)/xxxx 94/4,5/1,5 (X/X), xxxxxxxxxxxxxxxx xxxx x xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx.
3.15.2 Xxxxxxxxxx (2.3)/xxxxxx (3.1): 9/1 (X/X), xxxxxxxxxxxxxxxx tank s xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx.
3.16 Xxxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx xxx 0,1 μx aflatoxinu X1 xx 1 xx xxxxxxxxxxx (3.2) xxxx xxxxx benzenu x xxxxxxxxxxxx (3.6), xxxxxxxxxx x xxxxxxxxxxxx xxx je xxxxxxx x xxxx 7 xxxxxx A.
4. Xxxxxxxxx
Xxx xxx 4 xxxxxx X.
5. Postup
|
5.1 Xxxxxxxx xxxxxx |
xxx xxxx 5.1, 5.2 x3.5 metody X. |
|
5.2 Xxxxxxxx |
|
|
5.3 Xxxxxxxxxx xx koloně |
5.4 Dvourozměrná xxxxxxxxxxx chromatografie
5.4.1 Xxxxxxxx xxxxxxx (xxxxx xxxxxxxx xx xxxxxxx 1)
Narýsovat xx xxxxx (4.8) xxx přímky xxxxxxxxxx xx xxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx (6 xx xx xxxxx xxxxxx), xxxxxx k xxxxxxxx xxxxxxx xxx xxxxxxxxxxxx. Xxxxxx na xxxxx xxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxx xxxx injekčních xxxxxxxxxxxxxx xxxx xxxxxxx:
- v xxxx X: 20 μx xxxxxxxxxxx extraktu xxxxxx xxxxxxxxx xxxxx xxxx 5.3,
- x xxxx B: 20 μx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16),
- v xxxx X: 10 μl xxxxxxxxxxxx roztoku (3.16),
- x bodu D: 20 μx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16),
- x xxxx X: 40 μx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16).
Xxxxxxx slabým xxxxxxx xxxxxxx xxxx xxxxxxxxx xxxxx (3.11). Xxxxxxx xxxxxx musí mít xxxxxx asi 5 xx.
5.4.2 Xxxxxxxx (xxxxx xxxxxxxx xx obrázku 1)
Xxxxxxxxxxxxxx se xxxxxx xx xxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx (3.15.1) [xxxxxx x xxxxxxxx 1 xx x xxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxx x xxxxxxxxx xxxxxxxxxx] ve xxx xx směru X, xxxxx xxxx rozpouštědla xxxxxxxxx x xxxxxxxxxx xxxxx. Vyjmout xxxxx x chromatografického xxxxx x xxxxxx xxxxxxxx 15 xxxxx xx xxx x při xxxxxxxx xxxxxxx.
Xxxx se xxxxxxxxxxxx vyvíjí za xxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx (3.15.1) [xxxxxx o xxxxxxxx 1 cm x xxxxxxxxxxxxxxxxx tanku x xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx] xx xxx xx xxxxx XX, dokud xxxx rozpouštědla xxxxxxxxx x vymezující linii. Xxxxxxx xxxxx x xxxxxxxxxxxxx xxxxx x xxxxxx oschnout xx xxx a při xxxxxxxx teplotě.
5.4.3 Interpretace xxxxxxxxxxxxx (xxxxx xxxxxxxx xx xxxxxxx 1)
Ozářit xxxxxxxxxxxx UV xxxxxxx, xxxxxxx xx xxxxx xxxxxx xx vzdálenosti 10 xx xx xxxxx (4.9). Xxxxx xxxxxx xxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxx aflatoxinu B1 xx standardního roztoku X, C, D x X. Xxxxxxxxx xxx xxxxxxxx xxxxxx, xxxxx xxxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxx x xxxxxxx xxxxx úhel x xxxxxxxxxx xxxxx. Xxxxxxxx X xxxxxx přímek xxxxxx xxxxx, xxx xxx xxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx X1 xxxxxxxxxxx x xxxxxxxx vzorku xxxxxxxxxx x xxxx X (obrázek 1). Xxxxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxx X1 však xxxx xxx x xxxx Q xxxxxxxxx xx průsečíku dvou xxxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxxxxx xxxx xxx 100 xxxxxx a protínajících xxxx B x X. Xxxxxxxx aflatoxinu X1 x xxxxxxxx xxxxxx se xxxxxxx, xxx xx xxxxxxx x xxxx 5.5.
5.4.4 Xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxx
Xxxxxxxxx xx xxxxx xxxxx (4.8) xxx xxxxxx xxxxxxxxxx xx dvěma xxxxxxxxxx xxxxxxxx, jak xx xxxxxxx xx xxxxxxxx xx xxxxxxx 1, x xxxxxx xx xxx X (xxx xxxxxxx 1) 20 μx xxxxxxxxxxxx extraktu xxxxxx, který xxx xxxxxx xxxxx xxxx 5.3, a x xxxx 20 μx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx (3.16). Xxxxxxx xxx xx xxxxxxx x bodu 5.4.2. Xxxxxx xxxxxxxxxxxx XX xxxxxxx (4.9) x ověřit xxx:
- xx xxxxxx xxxxxxxxxx X1 z extraktu x xx standardního xxxxxxx xxxxxxxxxx,
- fluorescence xxxxxx skvrn xx xxxxxxxx než xxxxxxxxxxxx xxxxx xxxxxxxxxx B1, xxxxx se vyvinula x bodu X xx xxxxx xxxxx.
5.5 Xxxxxxxxxxxxx stanovení
Stanovení xx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxx xxxxxxxxxxxxxx xxxxx xxxxxx xxxxxx:
5.5.1 Xxxxxxxx xxxxxx
Xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1 x xxxxxxxx xx stanoví xxxxxxxxxx intenzity fluorescence xxxxx xxxxxxxx s xxxxxxxxxx skvrn X, X x E xxxxxxxxxxxx roztoku. X xxxxxxx xxxxxxx se xxxxxxxxxxx. Pokud xx xxxxxxxxx fluorescence 20 μx xxxxxxxx xxxxxxxx xxx xxxxxxxxx 40 μx xxxxxxxxxxxx xxxxxxx, xxxxxx roztok 10 xxxx xxxx 100 xxxx xxxxxxxxxxxx (3.2) xxxx směsí xxxxxxx x xxxxxxxxxxxx (3.6), x poté xxxxx xxxxxxxx tenkovrstvé xxxxxxxxxxxxxx.
5.5.2 Xxxxxxxxxxxxxx měření
Intenzita xxxxxxxxxxxx xxxxx xxxxxxxxxx X1 xx změří xxxxxxxxxxxx (4.12) při xxxxxxxxx xxxxxx xxxxx 365 xx x xxxxxx xxxxxx xxxxx 443 xx.
Xxxxxxxx aflatoxinu X1 xx skvrnách xxxxxxxx xx xxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxxx xxxxxxxx x xxxxxxxxxx xxxxx C, X x E xxxxxxxxxxxx xxxxxxx.
5.6 Potvrzení xxxxxxxx xxxxxxxxxx X1
Xxx xxx 5.6 metody X.
6. Xxxxxxx xxxxxxxx
Xxx xxx 6 metody X.
7. Xxxxxxxxxxxxxx
Xxx bod 8 xxxxxx X.
8. Xxxxxxxxxxxxxxxxxx
Xxx "Xxxxxxxx", xxxx C xxx 2.
X. XXXXXXXX XXXXXXXX XX XXXXX X A X
1. Xxxxxxxxx
Xxxxxx xxxxxxxxxx xxxx xxx 5 % xxxx xx musí xx přípravě xxxxx xxxx 5.1 xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxx (b. x. 40 až 60 °X).
X takových xxxxxxxxx xxxx xxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx vyjádřeny xxxx xxxxxxxx neodtučněného xxxxxx.
2. Xxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxx
Xxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxx, xx. xxxxxx xxxx xxxxxxxx xxxxxxxxx xxxxx xxxx xxxx laboratořemi xx stejného xxxxxx, xx xxxxxxxx xx:
± 50 % xxxxxxx xxxxxxx xxx xxxxxxx xxxxxxx xxxxxxxxxx X1 x 10 μx/xx xx xx 20 μx/xx;
± 10 μg/kg xx xxxxxxx xxxxxxx xxxxxxx pro xxxxxxx xxxxxxx od 20 xx 50 μg/kg;
± 20 % xxxxxxx xxxxxxx pro xxxxxxx xxxxxxx xxxxx xxx 50 μx/xx.
Xxxxxxx k xxxxxxx
